6 PRUEBA DE LA ADNasa

PRUEBA DE LA ADNasa

Algunas bacterias excretan nucleasas que despolimerizan el DNA.

Objetivo:

Determinar las bacterias que pueden detectar la actividad de desoooxirribonucleasa.

Medio de cultivo:

Se utiliza agar ADNasa

Procedimiento:

Inoculación

Hacer una estría gruesa en una placa de agar ADNasa

Incubación

Incubar a 35-37ºC durante 24h.

Interpretación de resultados:

Se revela después de incubar y se agrega HCl 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado mostrando un halo alrededor de la estría en caso positivo.(aproximadamente 5 mm de diámetro)

FOTOS

Observamos que en las placas de la izquierda y la del medio hay un halo alrededor de la siembra, el hecho de que haya un halo en las dos placas nos indica que ha habido contaminación ya que solo en la placa de S. aureus debería haber aparecido un halo.

La placa de la derecha ha sido contaminada porque, el resultado observado después de tanto tiempo (incubando) se ha visto afectado, se pueden observar hongos.

5 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA

Los Staphylococcus coagulasa negativos pueden diferenciarse en dos grupos, según sean sensibles o no a la novobiocina.

Staphylococcus epidermidis es sensible, mientras que Staphyloccoccus saprophyticus no lo es.

Objetivo:

Comprobar la sensibilidad a la novobiocina

Medio de cultivo:

Se utiliza el mismo medio que el recomendado para la técnica del antibiograma; es decir el agar Mueller Hinton

Reactivo

Disco de novobiocina de 5μg, que pueden adquirirse comercializados.

Procedimiento:

Inoculación

Inocular superficialmente una placa de agar Mueller Hinton con una suspensión de microorganismos de concentración análoga a  la utilizada para los antibiogramas.

Dejar reposar quince minutos a temperatura ambiente y depositar en el centro de la placa un disco de novobiocina.

Incubación

Incubar a 35-37ºC durante 24h.

Interpretación de resultados:

Se considera al Staphylococcus sensible a la novobiocina cuando el halo de inhibición del crecimiento sea superior a 16mm.

En el caso que se observa en la foto de la izquierda, podemos observar un halo alrededor el disco de antibiótico.

En el caso que se observa en la foto de la derecha, los resultados han determinado la presencia de contaminación, aparición de hongos y otros microorganismos, ya que ha transcurrido demasiado tiempo hasta observar los resultados.

4 PRUEBA DE LA COAGULASA

PRUEBA DE LA COAGULASA

La coagulasa es un enzima producido por algunos microorganismos capaz de coagular el plasma.

Objetivo:

Diferenciación de Staphylococcus aureus de otros estafilococos.

Fundamento:

Observar la coagulación  del plasma por la acción de la coagulasa al poner en contacto el microorganismo problema con el plasma.

Material:

• Tubos de ensayo
• Asa de siembra
• Pipetas
• Mechero
• Estufa de cultivo
• Baño termostatizado a 37ºC

Reactivos:

• Plasma
• Microorganismo problema

Procedimiento:

• En un tubo se ponen 0,5 ml de plasma al que añadimos 0,5 ml de cultivo joven en medio líquido del microorganismo problema. Se pueden añadir 2-3 colonias con asa de siembra si se parte de un cultivo sólido y emulsionarlos con el plasma.

• Mezclar por rotación suave el tubo

• En baño termostatizado se incuba a 37ºC y se observa cada 30 minutos si se forma coágulo, inclinando el tubo suavemente. Si a las 4 horas no se forma coágulo se deja en estufa de cultivo durante 24h.

Interpretación de resultados.

• Prueba positiva; coagulasa +: formación de coágulo
• Prueba negativa, coagulasa -: No se forma coágulo

Se puede observar en la imagen de los resultados obtenidos, que el tubo que contiene S. aureus ha coagulado mientras que, en el tubo que contiene S. epidermidis ha quedado líquido. Es decir, el que contiene S. aureus es positivo al tener efecto coagulasa completo, mientras el S. epidermidis es negativo al no tener efecto coagulasa. es decir no hay formación de coágulo y por lo tanto la suspensión queda homogénea.

2 PRUEBA DE LA CATALASA

PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo .

El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de los hidratos de carbono.

La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndose en agua y oxígeno gas. Si se  acumulase el peróxido de hidrógeno en los microorganismos éstos morirían; por ello es fundamental la presencia de catalasa en los microorganismos.

Objetivo:

Comprobar la presencia de la enzima catalasa.

Fundamento:

Se pondrá en contacto el microorganismo problema con el peróxido de hidrógeno. Si el microorganismo tiene el enzima catalasa se formará oxígeno en estado gaseoso al reducir el peróxido de hidrógeno.

Material:

• Portaobjetos
• Pipeta Pasteur
• Asa de siembra
• Mechero

Reactivos:

• Peróxido de hidrógeno
• Microorganismo

Procedimiento:

• Con un asa se toma una colonia del microorganismo de 12-24h (la colonia no se debe coger de un Agar Sangre, ya que, los hematíes contienen catalasa y se podría dar resultados erróneos.
• Se coloca la colonia de microorganismo en un portaobjetos
• Encima del microorganismo se añade una gota de peróxido de hidrógeno
• Comprobar los resultados debido a la formación de burbujas (resultado positivo)

Interpretación de los resultados:

• Catalasa +: formación de burbujas de oxígeno inmediatamente
• Catalasa -: No aparecen burbujas

En esta imagen apreciamos como los dos microorganismo A (S. Aureus) y E (S.Epidermidis), tienen catalasa +. En los dos portaobjetos se producen burbujas, eso es debido a la enzima catalasa que contienen las dos bacterias.