PRUEBA DE LA OXIDASA
Esta denominación se le da de forma genérica al enzima citocromo oxidasa que participa en la transferencia de electrones en la cadena respiratoria hacia el oxígeno. La oxidasa se puede definir como el enzima que cataliza la transferencia de electrones del sustrato al oxígeno.
Los microorganismos aerobios obtienen energía por respiración y la almacenan en forma de ATP. El oxígeno es reducido a partir de un sustrato orgánico que procede de la nutrición con la intervención de un sistema de transporte de electrones denominado cadena respiratoria, produciéndose agua o peróxido de hidrógeno dependiendo de la especie microbiana.
Objetivo:
Detectar en el microorganismo estudiado el enzima citocromo oxidasa
Diferenciar enterobacterias (oxidasa -) de Pseudomonas (oxidasa +)
Diferenciar entre géneros de microorganismos: Moraxella (+) y Neisseria (+) de Acinetobacter (-)
Fundamento:
Se detecta oxidasa en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Los anaerobios estrictos carecen de ella.
Se determina a través de esta prueba la presencia o ausencia de citocromo oxidasa en el microorganismo, el cual cataliza el último paso de la transferencia de electrones desde un sustrato orgánico (azúcares, polipéptidos…) al oxígeno.
Para ello se observará el cambio de color de un indicador de pH incoloro cuando está reducido y coloreado cuando se oxida.
Entre los indicadores más utilizados se encuentra la p-fenilendiamina, que por acción del enzima citocromo oxidasa da un compuesto químico indofenol que contiene color.
Material:
· Pipeta pasteur
· Placa de Petri o portaobjetos
· Asa de siembra
· Mechero
· Papel de filtro
Reactivos:
· Placa de Petri con medio apropiado para el microorganismo (Ver técnica)
· Reactivo oxidasa de Kovacs
Procedimiento:
· Se cultiva en una placa de Petri con agar sangre el microorganismo problema. Se puede utilizar otro medio que sea más conveniente para el crecimiento del microorganismo investigado. Los medios que contengan glucosa pueden inducir a falsos resultados negativos debido a que la fermentación de la glucosa inhibe la actividad de la oxidasa
· Sobre una placa de Petri o portaobjetos se coloca un trozo de papel de filtro sobre el que dejamos caer 2 ó 3 gotas de reactivo de Kovacs. La tira de papel de filtro impregnada con reactivo puede ser sustituido por discos comerciales ya preparados que antes de utilizarlos deben rehidratarse con unas gotas de agua destilada.
· Se toma una colonia con el asa de siembra y se extiende en el papel.
· El resultado se lee en 5-10 segundos.
· Se puede realizar esta técnica de otra manera. Añadiendo directamente el reactivo oxidasa de Kovacs sobre las colonias de la placa de Petri con agar sangre. Si son oxidasa positivos toman un color marrón y enseguida pasan a negro parduzco.
Interpretación de los resultados:
· Oxidasa +: aparece un color purpúreo en el papel. Si se desarrolla el color a los 10-60segundos se considera oxidasa retardado positivo.
· Oxidasa -: No se produce color.
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Mediante esta imagen, apreciamos como en los dos portaobjetos no ha cambiado el color. Los dos microorganismos (S. Aureus y S. Epidermidis) son oxidasa -, y tenemos los resultados en mojado, y el color no varía en ninguno.
